产品目录

保存：-20℃

产品说明：
Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)是目前电泳法变性分离多肽的主要方法。此试剂可以制备20/50块0.75mm×14cm×14cm胶。
使用方法：
推荐在分离多肽时使用由4%浓缩胶、10%隔离胶和16%分离胶从上到下组成的三层Tricine-SDS-PAGE胶，下面为配制该胶的流程。
1.配制30mL 16%分离胶和9mL 10%隔离胶(足够灌两块0.75mm×14cm×14cm胶)。
A)标记2个50mL的三角瓶，按下表的用量加入各成分：
B)混匀后真空脱气10～15分钟。
C)在分离胶瓶中加入150μL 10%的APS溶液和30μL TEMED溶液，轻轻旋转混匀。
D)灌胶。用一根巴斯德吸管，将分离胶溶液沿着一个隔条的边缘加到玻璃板夹层中，直到溶液的高度距离玻璃上沿还有5cm。由于分离胶比重比隔离胶大，故可在其凝固前直接灌隔离胶。
E)在隔离胶瓶中加入75μL 10%的APS溶液和15μL TEMED溶液，轻轻旋转混匀。
F)灌胶。用巴斯德吸管，将积层胶溶液缓缓地沿着一侧隔条边缘加入到玻璃平板夹层中，直到溶液离玻璃板顶部约3cm高为止。
G)盖1cm高的水饱和的异丁醇使胶面跟氧气隔绝(氧气会抑制胶的凝固；此处水饱和的异丁醇可用水代替，但效果会差一些)。
H)让分离胶和隔离胶在室温聚合30～45分钟。
2.配制9mL 4%浓缩胶(足够灌两块0.75mm×14cm×14cm胶)。
A)在一个50mL的三角瓶中，先按下表的用量加入各成分：
B)混匀后真空脱气10～15min。
C)将75μL新鲜配制的10%的过硫酸铵溶液和15μL TEMED溶液加入到溶液中，轻轻旋转混匀。
D)灌胶。用巴斯德吸管，将积层胶溶液缓缓地沿着一侧隔条边缘加入到玻璃平板夹层中，直到夹层中的溶液离玻璃板顶部约1cm高为止。
E)插入0.75mm厚的塑料梳子，再补加浓缩胶溶液填满梳子间的空隙。注意避免产生气泡。
F)让浓缩胶在室温聚合30～45分钟。
3.小心拔出塑料梳子，在上层缓冲槽中加入1×阴极缓冲液，并用1×阴极缓冲液冲洗加样孔。
注：10×Tricine-SDS-PAGE阴极缓冲液用去离子水1:9稀释成1×阴极缓冲液。
4.在电泳装置的下层缓冲液槽中加入1×阳极缓冲液。
注：10×Tricine-SDS-PAGE阳极缓冲液用去离子水1:9稀释成1×阴极缓冲液。
5.在密封的螺盖微量离心管中，用2×Tricine多肽上样缓冲液按1：1的比例稀释蛋白样品，于100℃煮沸3～5分钟。
注意：如果样品是蛋白沉淀物，则加入50～100μL新配的1×Tricine-SDS-PAGE上样缓冲液溶解；如果样品是蛋白稀溶液，可先浓缩蛋白质。与Tricine-SDS-PAGE上样缓冲液混合后的样品如未经100℃加热灭活蛋白酶，切勿放于室温。
6.上样。如果用考马斯亮蓝染色，对于成分复杂的蛋白质样品，上样量最好为20μL(含25～50μg总蛋白质)；对于只有一种或几种蛋白质的样品，上样量最好为1～10μL。如果用银染，上样量可减少10～100倍。
7.电泳。先30 V恒压电泳1h(对0.75mm×14cm×14cm的胶而言)，然后150 V恒压电泳4-5h。注：本产品的Tricine-SDS-PAGE上样液使用了考马斯亮蓝G-250作为指示剂，其泳动速度比最小的肽还快。
8.终止电泳，取出凝胶进行后续的实验处理(最好用银染染色，节约样品)。
注意：考染或银染时，基本步骤同蛋白电泳，但任何一步(尤其是固定步骤)的处理时间都不要超过20分钟，否则多肽非常容易扩散出PAGE胶而降低检测的灵敏度。
相关搜索：2×Laemmli上样缓冲液(不含DTT)，2×Laemmli Loading Buffer(without DTT)